在 qPCR 實驗過程中,經(jīng)常會遇到異常擴增曲線和熔解曲線的困擾,那么qPCR曲線常見問題有哪些呢?該如何解決呢?讓我們一起來看看吧!
一、擴增曲線相關問題
1.無擴增曲線
可能原因:
(1)沒有打開熒光信號采集。檢查程序設置,三步法擴增程序在 72℃ 延伸階段采集信號,兩步法擴增程序的信號采集設置在退火延伸步驟。
(2)引物降解。可通過 PAGE 電泳檢驗引物的完整性。
(3)模板濃度低。建議增加模板投入量或重新制備較高濃度模板。
2. 擴增曲線不光滑
可能原因:
(1)儀器長時間未校準,在檢測中出現(xiàn)了波動,建議定期校準儀器;
(2)RNA 模板不純,建議增大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備較高純度的 RNA 模板。
3. 擴增曲線平臺期抖動
可能原因:儀器與管材不匹配導致的信號采集產(chǎn)生波動。
4. 擴增曲線右下方下落呈倒扣狀
可能的原因:模板濃度過高,基線終點值大于 CT 值,儀器默認起峰位置仍為基線期,將起峰位置往基線下拉,所以擴增曲線變成了倒扣的 S 形(左圖)??蛇m當減小基線范圍,手動調(diào)整基線終點值至 CT 值 -4,調(diào)整基線范圍后,擴增曲線即恢復正常(右圖)。
二、熔解曲線相關問題
1. 有擴增曲線無溶解曲線
可能原因:檢查是否有設置熔解曲線步驟或熔解曲線信號采集是否打開。
2. 熔解曲線雜峰
(1)雜峰在主峰之前
可能的原因:雜峰在主峰之前,Tm 在 70~75℃ 范圍內(nèi),一般是引物二聚體。引物二聚體是引物 3’ 端的部分堿基互補結合,在 Taq 酶的作用下,3’ 端延伸后得到的小分子量的雙鏈 DNA 片段??筛鶕?jù) NTC(無模板陰性對照)判斷是否為引物二聚體。
解決方案:建議通過提高模板濃度、提高退火溫度、降低引物濃度來改善。
(2)雜峰在主峰之后
可能的原因:非特異性擴增,可能由于引物特異性較差,或體系中有氣溶膠污染(可結合 NTC 確定體系是否有污染)。建議先提高退火溫度,可提高擴增特異性。如果提高退火溫度對于特異性沒有改善,建議更換特異性較高的引物。
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