流式細(xì)胞儀(flow cytometry,F(xiàn)CM)作為一種強(qiáng)大的單細(xì)胞分析工具,可以對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。那么流式細(xì)胞儀的常見問題有哪些呢?讓我們一起來看看吧!
一、抗體孵育時間過長會影響檢測結(jié)果嗎?
通常情況下,標(biāo)記細(xì)胞表面抗原的熒光抗體需要在室溫孵育20-30分鐘。
對于一些狀態(tài)較脆弱的細(xì)胞(例如從組織中分離、培養(yǎng)的免疫細(xì)胞),切勿過長時間孵育,同時建議使用染色緩沖液(Staining Buffer),其中主要成分為PBS,疊氮鈉和胎牛血清,胎牛血清可以減少抗體的非特異性結(jié)合,疊氮鈉可以維持細(xì)胞表面抗原的穩(wěn)定性。
對于胞內(nèi)或者核內(nèi)標(biāo)記抗體,可以在固定、破膜后適當(dāng)延長孵育時間,或者破核膜同時孵育核內(nèi)抗體。
二、樣本不能及時上機(jī)檢測,血樣和組織樣本的保存方法?
通常情況下建議樣本處理至表面抗體孵育結(jié)束,再用1%多聚甲醛重懸固定4℃保存至下一步,或者4%多聚甲醛固定10分鐘后洗去,用StainingBuffer重懸,4℃保存至下一步,48小時內(nèi)上機(jī)檢測。如不具備前處理條件,外周血可以使用流式專用保存管存放,組織樣本剪成小塊后用保存液存放,建議不錯過3天進(jìn)行前處理和上機(jī)檢測。
三、流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期,各個周期峰分不開,只有一個寬峰是為什么?
①如果是持續(xù)出現(xiàn)這種情況,說明儀器的PI檢測通道CV值過高,管路需要深度清潔或者更換。
②前處理過程中出現(xiàn)的問題,如:乙醇固定條件(濃度、時間)的改變造成通透不wan全、RNA沒有處理wan全、通道CV較差同時受到異倍體干擾等。
③如果個別組出現(xiàn)此情況,可能是受到實驗處理條件的影響,如:轉(zhuǎn)染的熒光干擾、集中在周期區(qū)間的抑制、對細(xì)胞影響過大等。
四、鈣離子(Ca2+)流式檢測如何設(shè)置對照?
Ca2+檢測通常使用Fluo-3、Fluo-4等熒光探針,這類探針通常會在活細(xì)胞內(nèi)與鈣離子結(jié)合發(fā)出熒光,進(jìn)行相關(guān)成像或流式檢測。因此鈣離子檢測會有靜態(tài)檢測和動態(tài)檢測兩種方法。
靜態(tài)檢測主要用于檢測相對胞內(nèi)濃度變化,需要設(shè)置空白對照、陰性對照、陽性對照,以相對的方式檢測熒光值。
動態(tài)檢測主要用于檢測鈣動員的情況,監(jiān)測加入刺激劑后的Ca2+變化情況。通常用于檢測一些免疫細(xì)胞,也可以用于分析不同淋巴細(xì)胞亞群的變化情況。
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