RNA是目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生物功能zui豐富多樣的生物大分子,同時是DNA與蛋白質(zhì)信息傳遞的橋梁,因此完整RNA的提取和純化是功能基因組時代的重要手段,那么你知道RNA提取的實驗步驟是什么嗎?讓我們一起來看看吧!
以Trizol法提取組織細(xì)胞為例:
1.提取細(xì)胞RNA時,先離心沉淀細(xì)胞,每5~106個細(xì)胞加1ml Trizol后,反復(fù)用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細(xì)胞;
2.將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30℃下放置5分鐘;
3.在上述EP管中,按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15~30℃)放置2~3分鐘后,12000g(2~8℃)離心15分鐘;
4.去上層水相置于新EP管中,按照每1ml Trizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15~30℃)放置10分鐘后,12000g(2~8℃)離心10分鐘;
5.棄上清,按照每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g(2~8℃)離心5分鐘,棄上清;
6.讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥;
7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
8.RNA檢測
(1) RNA的電泳圖譜,電泳的目的是在于檢測28S、18S、5S條帶的完整性和他們的比值,一般的,如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利,并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
(2) 測定樣品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA計算RNA的產(chǎn)量,一般的OD260/OD280在1.8-2.0范圍,我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的,如果R<1.8,說明溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯,如果R>2.2,說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
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