目前常用紫外分光光度法檢測核酸的濃度及純度。
一、檢測原理
紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環(huán)結構在紫光區(qū)具有較強吸收,DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰,蛋白質在280nm處有最大的吸收峰,鹽和小分子則集中在230nm處。因此,可以用260nm波長進行分光測定核酸濃度,OD值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA,單鏈DNA濃度約為33ug/ml,RNA約為40ug/ml,寡核苷酸約為35ug/ml。如用H,O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H,O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度
二、DNA純度比值
DNA 純度比值是表示DNA樣本中 DNA 的相對濃度的指標,它是通過測量樣本中不同物質的含量來計算的。A280nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長,純DNA的A260/A280比值為1.8,純RNA為2.0。假如比值低,表示受到蛋白(芳香族)或分類物質的污染,需要純化樣品。比值=1.5相當于50%蛋白質/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長,純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染,需要純化樣品。
三、DNA純度比值可能受到以下因素的影響
1. 樣本收集和存儲方法:樣本在收集和存儲過程中可能會受到污染,影響DNA純度。
2. DNA 提取方法:不同的DNA提取方法可能導致DNA純度的不同。
3. 生物樣本的特性:不同的生物樣本中的DNA含量和組成也可能導致DNA純度的不同。
4. 純化步驟:在純化DNA時,不同的純化方法和操作步驟可能對DNA純度產生影響。
5. 測量方法:不同的測量方法可能產生不同的DNA純度比值。
因此,為了確保DNA純度的準確性,需要在每個步驟中注意控制可能影響DNA純度的因素,并使用適當的方法和技術進行測量。
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