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【干貨】一文了解vero細胞培養(yǎng)全流程

 更新時間:2023-10-08 點擊量:946


Vero細胞系是連續(xù)非整倍體細胞,連續(xù)細胞系可以經(jīng)過多次分裂而不衰老,非整倍體是指細胞中的染色體數(shù)目與通常的不同。與其它普通哺乳動物細胞不同,Vero細胞還有干擾素分泌缺陷的特點,當被病毒感染時,它不能分泌干擾素,但它仍然具有α/β-干擾素的受體,所以對于其它來源的干擾素仍有正常的反應。

一、基本信息

細胞名稱:Vero非洲綠猴腎細胞

細胞別稱:VERO; Verda reno

細胞形態(tài):上皮細胞樣

生長特性:貼壁生長

組織來源:正常腎

培養(yǎng)基:MEM+10%FBS+1%PS

生長條件:

氣相:95%空氣+5%二氧化碳;

溫度:37℃

傳代方法:1:21:3,每周2-3次。

二、培養(yǎng)指南

1. Vero細胞復蘇步驟

(1)1mL Vero細胞懸液凍存管于37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基進行混合均勻;

(2)1000rpm條件下離心4min,棄上清液,再加入1-2mL培養(yǎng)基后輕輕吹打混勻;

(3)Vero細胞懸液加入到含有適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤氲?/span>6cm皿中,加入約4mL的培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜);

(4)第二天換液并觀察Vero細胞密度。

2. Vero細胞傳代步驟

Vero細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

(1)1mL Vero猴腎細胞懸液凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻;

(2)1000rpm條件下離心4min,棄上清液,再加入1-2mL培養(yǎng)基后吹打混勻;

(3)Vero猴腎細胞胞懸液加入到含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤氲?/span>6cm皿中,加入約4mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜);

(4)第二天換液并觀察Vero細胞密度。

3. Vero細胞凍存步驟

Vero細胞生長狀態(tài)良好,可進行細胞凍存。以T25瓶為例:

(1)收集Vero細胞及細胞培養(yǎng)液,裝入無菌離心管中,于1000rpm條件下離心4min,棄上清液,用PBS清洗一遍,棄掉PBS后進行細胞計數(shù)。

(2)根據(jù)Vero細胞數(shù)量對應加入無血清細胞凍存液,使細胞密度在5×106~1×107/mL之間,輕輕混勻,每支凍存管凍存1mL細胞懸液,注意凍存管上做好標識。

(3)將凍存管放入-80℃冰箱中,24h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。

三、注意事項

1. 培養(yǎng)基不能回收使用

灌液培養(yǎng)基不能再用來培養(yǎng)細胞,請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的wan全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。

2. 細胞到貨處理說明

(1)收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。

(2)觀察好細胞狀態(tài)后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h

(3)收到Vero細胞后第一次傳代建議1:2傳代,1:2傳代是指1T25瓶傳2T25瓶或者26cm皿,而不是1T25瓶傳210cm皿。

四、常見問題

1. vero細胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點?

處理方法:在細胞消化離心棄上清后,使用PBS重懸洗滌,在750rpm條件下低速離心4min,重新鋪下,然后鏡下觀察是否干凈。

2. vero細胞生長過慢?

(1)更換不同培養(yǎng)基或血清導致

解決方法:分析新培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的成分,比較新血清與原血清支持細胞生長實驗,讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)基。

(2)有少量細菌或真菌污染

解決方法:用含抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,盡量丟棄培養(yǎng)物。

(3)試劑保存不當導致

解決方法:血清需要保存在-10-20℃;

培養(yǎng)基需在2-8℃避光保存;

含血清wan全培養(yǎng)液在2-8℃保存。

(4)接種細胞起始濃度太低

解決方法:增加接種細胞起始濃度。

(5)細胞已老化

解決方法:引入新的保種細胞,重新培養(yǎng)。

(6)支原體污染

解決方法:吸取部分培養(yǎng)基,離心得上清,檢測支原體;

清潔支架和培養(yǎng)箱;

可在培養(yǎng)皿里加入支原體去除劑清除;

如發(fā)現(xiàn)支原體污染,建議盡量丟棄。

3. vero細胞培養(yǎng)過程中不貼壁?

(1)胰酶消化過度導致

解決方法:嘗試縮短胰酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

(2)支原體污染

解決方法:吸取培養(yǎng)2-3的培養(yǎng)基,檢測支原體;

清潔支架和培養(yǎng)箱;

 如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

(3)培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解)

解決方法:使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2。

(4)細胞老化

解決方法:購買新的代數(shù)較低的細胞。

(5)接種細胞起始濃度太低或太高

解決方法:調(diào)節(jié)最佳接種細胞濃度。

4. vero細胞用什么培養(yǎng)基?

vero細胞培養(yǎng)基:MEM+10%FBS+1%P/S

5. vero細胞DMSO凍存比例?

凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配或無血清細胞凍存液。

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