你知道流式細(xì)胞周期檢測的常見問題有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!
一、樣本制備注意事項(xiàng)
1.根據(jù)不同的檢測細(xì)胞調(diào)整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養(yǎng)環(huán)境,注意一定要無菌的環(huán)境培養(yǎng)。
2.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),以對數(shù)期處理為宜,避免細(xì)胞量過少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。
3.流式檢測細(xì)胞周期上機(jī)檢測所需收集細(xì)胞量較多,收集細(xì)胞時(shí)盡量多收集一些
4.流式檢測對細(xì)胞離心,重懸次數(shù)較多,注意動(dòng)作輕緩,避免過多地?fù)p傷、弄破細(xì)胞。
5.本實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞離心,重懸次數(shù)較多,注意動(dòng)作輕緩,避免過多地?fù)p傷細(xì)胞。
6.細(xì)胞周期待測細(xì)胞盡量要獲得單個(gè)細(xì)胞,避免DNA的降解。
7.樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結(jié)合,又能與RNA結(jié)合,所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要,建議用商品化試劑。
8.污染脫氧核糖核酸酶會(huì)降解DNA,故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。
9.染液等物質(zhì)有一定毒性,注意防護(hù)。
二、流式檢測時(shí)的注意事項(xiàng)
1.固定時(shí)必須預(yù)冷PBS重懸打入無水乙醇中,做到隨加隨混勻,避免細(xì)胞形成團(tuán)塊。
2.固定后細(xì)胞雖然可以保存較長時(shí)間后再上機(jī)檢測,為避免不可控因素影響最好盡早上機(jī)檢測。
3.進(jìn)樣速度:一般檢測細(xì)胞濃度調(diào)整為2*10^5到2*10^6/ml,建議進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大,可能就是進(jìn)樣速度太快。
4.儀器質(zhì)控定期做,檢查質(zhì)控微球的CV值,盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬。
5.通過電壓脈沖信號(hào)的寬度、高度、面積等參數(shù)區(qū)別實(shí)體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體,zui大程度的減少粘連細(xì)胞帶來的假陽性結(jié)果。
6.選擇合適的細(xì)胞系,不同的細(xì)胞系由于細(xì)胞形態(tài)、直徑等不同,會(huì)對結(jié)果的美觀程度有一定的影響,筆者常用HeLa細(xì)胞系,峰形較細(xì),周期各階段明顯區(qū)別,結(jié)果美觀。
7.建議選擇6孔板操作,細(xì)胞給藥密度在40%左右,給藥時(shí)間不一定要與蛋白印跡法給藥時(shí)間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達(dá)的變化,例如給藥10小時(shí),蛋白上可見明顯變化趨勢,但10小時(shí)收樣時(shí),孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯觀察到細(xì)胞漂浮凋亡,那對流式檢測的結(jié)果會(huì)有很大的影響。流式細(xì)胞術(shù)收樣時(shí),盡量保證孔內(nèi)細(xì)胞還未漂浮。
8.收樣時(shí),如果孔內(nèi)已經(jīng)有細(xì)胞漂浮,細(xì)胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化,消化時(shí)間必須嚴(yán)格控制,及時(shí)終止消化,消化時(shí)間太久,容易對細(xì)胞造成損傷和死亡。
9.收集細(xì)胞時(shí),離心機(jī)選用4℃,300-500g離心5分鐘,小心吸去上清。加入0.3 mL預(yù)冷的PBS,將管內(nèi)的細(xì)胞混勻后,再加入0.7 mL預(yù)冷的無水乙醇,4℃固定過夜。整個(gè)收樣過程中,不要用槍頭劇烈吹打細(xì)胞,一是會(huì)損傷細(xì)胞,二是造成細(xì)胞損失。
10.上機(jī)前,離心機(jī)選用4℃,300-500g離心5分鐘,棄去上清。此時(shí)格外需要注意的是由于不同時(shí)期細(xì)胞的重量不一樣,離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底,管壁上也會(huì)存在大量細(xì)胞,去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液,避光染色15分鐘以上,上機(jī)測試前最好使用200目篩網(wǎng)過篩,以免細(xì)胞聚集堵塞機(jī)器管道。
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