質(zhì)粒構(gòu)建是指選定的目的外源基因(DNA)先要經(jīng)過PCR擴增。隨后用限制性內(nèi)切酶分別切割載體和外源DNA片段,再使用DNA連接酶將切割后的載體與DNA片段連接,轉(zhuǎn)入宿主細胞。最后經(jīng)過篩選鑒定出正確的重組克隆質(zhì)粒,實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內(nèi)的正確表達。那么質(zhì)粒構(gòu)建實驗影響因素有哪些呢?讓我們一起來看看吧!
一、載體的選擇
在選擇克隆載體時應注意以下幾點:
①具有自主復制能力,拷貝數(shù)高;
②攜帶易于篩選的選擇標記;
③含有多種限制酶的單一識別序列,以供外源基因插入;
④載體應盡可能?。ǎ?5kb),便于導入細胞和進行繁殖;
⑤使用安全??寺≥d體應只存在于有限范圍的宿主內(nèi),在宿主體內(nèi)不進行重組,不發(fā)生轉(zhuǎn)移,不產(chǎn)生有害性狀,并且不能離開工程宿主自由擴散。
二、引物設(shè)計注意事項
在構(gòu)建質(zhì)粒時,設(shè)計引物時應該考慮引物長度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素,并避免引物間出現(xiàn)配對突變或二次結(jié)構(gòu)等情況。
前向引物:5’端 -- 上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴增引物 --3’端
反向引物:3’端 -- 基因反向擴增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端
運用PCR擴增目的基因的過程中,引物設(shè)計注意事項:
① 引物長度最好在18-30bp左右,常用的長度是 20-22bp;
②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右,兩條引物間 Tm 值要保持接近,相差最好不要超過 5°C;
③GC 的含量標準通常為 40%-60% 或45-55%;
④引物自身不應含有連續(xù)超過4個的互補的堿基,避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或形成引物二聚體;
⑤引物的3’端要避免出現(xiàn)連續(xù)重復的堿基,如 GGG 或 CCC ,這會導致錯配的發(fā)生,最后一個堿基最好是 G 或 C;
⑥在引物的 5’端添加酶切位點時(在不影響擴增的特異性的前提下),根據(jù)酶切位點序列,需要添加不同種類和數(shù)量的保護堿基,通常多加3個堿基即可滿足保護酶切位點的需求;
⑦上下游引物最好加入不同的酶切位點,相同的酶切位點可能導致目的基因片段出現(xiàn)倒置連接現(xiàn)象,影響基因序列的正常表達。
三、酶切位點的選擇
選擇合適的剪切酶和連接酶對于質(zhì)粒構(gòu)建至關(guān)重要。剪切酶的選擇應該考慮酶切位點的位置、酶的反應條件等因素。連接酶的選擇應該根據(jù)所用的質(zhì)粒載體和目的基因的大小來確定。
①選擇質(zhì)粒上兩個酶切位點的距離不應小于太?。?gt;10bp),否則影響限制性內(nèi)切酶對切點的識別,不利于空載體的雙酶切。
②一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點的選擇要考慮到:
目的基因片段內(nèi)部不含有所選的酶切位點(不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷)。
③實驗后繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確(定向克隆)。(不然換載體表達時,還要重新設(shè)計引物,以引進新的酶切位點)。
④盡可能選比較常用的酶切位點(常用切點酶的價格比較便宜)。
⑤兩個酶切點至少隔上3個堿基。
⑥兩個酶切點最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。
⑦最好使用酶切效率高的酶。
⑧最好使用雙酶切有共同buffer的酶。
⑨在操作酶切連接的步驟時也要定性定量,保證酶活性充足。
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