熒光原位雜交是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),是 20 世紀(jì) 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。那么影響熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的因素有哪些呢?讓我們一起來(lái)看看吧!
一、固定液的選擇及固定時(shí)間
①石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定12~48h,其它固定液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。
②組織標(biāo)本離體后應(yīng)盡快固定,較大標(biāo)本切開(kāi)固定。如樣本固定不及時(shí),熒光信號(hào)會(huì)減弱。(尤其環(huán)境溫度較高時(shí)更應(yīng)及時(shí)固定)
③固定液體積應(yīng)不少于標(biāo)本體積的10倍,否則固定不充分,容易出現(xiàn)無(wú)信號(hào)或者信號(hào)很弱的現(xiàn)象。
④為了保證信號(hào)的準(zhǔn)確性,蠟塊最好在2年內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),已經(jīng)切好的切片在6周內(nèi)檢測(cè)最佳。
二、組織切片和載玻片的選擇
組織切片4~5μm厚,過(guò)厚或過(guò)薄的切片均會(huì)對(duì)信號(hào)的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響,切片過(guò)厚將導(dǎo)致雜交不充分,最終信號(hào)點(diǎn)發(fā)生重疊,影響計(jì)數(shù)。而且切片應(yīng)完整,質(zhì)量良好,否則會(huì)在預(yù)處理時(shí)掉片。
載玻片的選擇建議使用防脫載玻片,有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽(yáng)離子或者陰離子專用載玻片,可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。
三、切片的預(yù)處理
切片預(yù)處理過(guò)程包括煮沸處理和蛋白酶消化。
①當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過(guò)厚或烤片不足時(shí),在煮沸過(guò)程中容易掉片,建議烤片溫度在56℃過(guò)夜。煮沸過(guò)程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)溫度和時(shí)間。
②酶消化是FISH實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一,如果對(duì)組織不熟悉,可以先消化推薦的反應(yīng)時(shí)間,然后復(fù)染DAPI在熒光顯微鏡下觀察,在DAPI通道下,以細(xì)胞既無(wú)空洞(消化過(guò)度),亦無(wú)明顯的云霧狀(消化不足)為最佳,同時(shí)可切換觀察紅綠通道,以紅綠通道無(wú)明顯的背景為佳,如果背景較高,可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。
③對(duì)于陳舊的石蠟組織切片,要適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間,否則會(huì)出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。
四、變性和雜交
變性和雜交是本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟,變性的時(shí)間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵,變性和退火溫度對(duì)熒光信號(hào)影響較大,變性和退火溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致雜交效率變低,使熒光信號(hào)變?nèi)酰冃院屯嘶饻囟冗^(guò)高易出現(xiàn)高背景。
為保證變性期間溫度的穩(wěn)定,建議采用專業(yè)的原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交步驟,不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)的繁瑣性,而且更有利于實(shí)驗(yàn)條件的控制,比如時(shí)間、溫度和避光條件等。
為避免雜交液在變性和雜交過(guò)程中的損失和防止干片,一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進(jìn)行密封。
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